LA TECHNIQUE HISTOLOGIQUE a pour but l'obtention de coupes minces, transparentes de tissus et d'organes observables au microscope, le plus souvent après coloration par des colorants spécifiques qui donnent aux diverses parties des teintes différentes. On doit donc chercher à conserver l'objet à étudier dans un état aussi voisin que possible de l'état vivant, tout en le rendant imputrescible, puis on pénètre cet objet avec une substance demi-dure, qui lui donne une consistance suffisante et une homogénéité relative, favorables à la confection de coupes minces, ensuite on porte ces coupes en les étalant sur une lame de verre à laquelle elles adhèrent, on les colore dans des bains de teinture, on les recouvre d'un milieu de même réfringence que le verre et d'une mince lamelle de verre. On obtient ainsi des préparations persistantes, parfaitement observables au microscope à la lumière transmise.

L'ensemble des opérations comprend :

A LE PRELEVEMENT

Il doit être pratiqué le plus tôt possible après la mort, parfois sur le vivant (biopsie) : éviter de triturer ou malaxer l'organe, le détacher et, avec un instrument bien tranchant, découper des tranches peu épaisses en tenant compte de l'orientation générale de l'organe pour orienter le prélèvement, les pièces doivent avoir 2 à 3 mm d'épaisseur pour la cytologie.

Ces prélèvements doivent être portés imédiatement au laboratoire dans une assez grande quantité de liquide fixateur

B FIXATION DES PIECES

  1. la fixation consiste à protéger les tissus prélevés de toute hydrolyse due à la libération des enzymes contenus dans les lysosomes cellulaires.
  2. la congélation (abaissement brutal de la température à -20° . -50°) empêche l'autolyse et le prélèvement durci peut être coupé.
  3. La cryodessication associe à la congélation l'évaporation complète et sous vide de l'échantillon, l'élimination de l'eau empêche l'hydrolyse et le maintien de petites molécules difficiles à conserver autrement
  • ces méthodes physiques exigeant un matériel couteux sont réservées à des cas particuliers ou en recherche.

La pratique courante de l'histologie a développé plus largement des méthodes de fixation chimique utilisant les propriétés spécifiques de certaines molécules.

Fixation Chimique : mécanismes généraux

Il s'agit d'une conservation des protéines essentiellement. les sucres sont plus difficiles à préserver.

On ne sait pas exactement comment le fixateur agit il détermine une coagulation ou une polymérisation des structures et apporte un durcissement des tissus. (toute étude histenzymologique n'est plus possible).

Principaux fixateurs

deux grand goupes :

  • les fixateurs simples : souvent utilisés à l'état pur
  • les mélanges fixateurs : plus couramment utilisés
  • fixateurs simples
  • Ethanol ou alcool éthylique : fixe bien les lgucides, mais il a l'inconvénient de durcir les tissus et est un solvant des graisses. Il est utilisé à la concentration de 70 à 100 %. Il entre également dans la composition de nombreux mélanges fixateurs.
  • Liquide de Carnoy : alcool + Chloroforme + acide acétique. Il est utilisé pour les très petits prélèvements (5 minutes), il fixe bien les noyaux.
  • Formaladéhyde : gaz utilisé en solution aqueuse : formol (gaz et sa solution) à la concentration de 10 à 20 %. Il est utilisé seul ou en mélange le liquide de Bouin (formol + acide picrique)
  • Le formol permet de bien conserver les tissus mais il a l'inconvénient d'irriter les mmuqueuses nasales et oculaires, de provoquer des dermites
  • mélanges fixateurs
  • Acide acétique : de 0,3 à 10 % dans Boin, Carnoy....c'est un bon fixateur nucléaire, mais le collagène gonfle et les mitochondries sont altérées
  • pénétration rapide
  • les graisses ne sont pas altérées
  • Acide trichloracétique : 5 à 10 % Equivalent à l'acide acétique mais a un pouvoir décalcifiant
  • Acide picrique En solution dans l'eau ou l'éthanol (liquide de Boin)
  • hydraté : coloration jaune
  • cristallisé : incolore, explose

C INCLUSION

le mode d'inclusion à la paraffine est le plus répandu. "paraffine" est un mélange d'hydrocarbures saturés et quelquefois de cires. Les paraffines 56-58° conviennent dans la majorié des cas. La paraffine n'est pas miscible à l'eau, les pièces fixées doivent etre déshydratées. Le déshydratant le plus courant est l'alcool éthylique. Mais comme la paraffine n'est pas non plus miscible à l'alcool, celui-ci sera remplacé avant inclusion par un liquide intermédiaire miscible à l'alcool et à la paraffine. On utilise le xylène . Ce liquide est "éclaircissant" ce qui permet d'apprécier le degré de pénétration par la transparence acquise par la pièce.

D CONFECTION DES COUPES images

    le bloc de paraffine

    • le tailler avec un bistouri
    • le fixer sur le porte bloc
      • chauffer le plateau
      • appliquer le plateau chaud sur la paraffine
      • immerger immédiatement dans lde l'eau froide, la paraffine fondue permet
      • de souder le bloc sur le porte objet

le microtome

  • reculer le porte objet au maxium
  • placer le bloc dans le prte objet sans le fixer
  • placer le rasoir face gravée vers l'extérieur : e fixer (face à couper dans un plan vertical, paralèle au fil du rasoir, les deux arêtes du bloc les plus ongues horizontalement
  • dégrossir à la main
  • régler l'épaisseur des coupes (5 microns)
  • mettre le cliquet
  • couper

DIFFICULTES

  • Les coupes ne se font pas vérifier le cliquet, l'inclinaison du rasoir, la fixation du porte objet
  • coupes striées essuyer le rasoir ou le déplacer
  • coupes irrégulières vérifier la fixation du rasoir et du porte-objet

E COLLAGE DES COUPES schéma

PREPARATION DE LA SOLUTION DE COLLAGE

Albumine d'oeuf, une pincée dans de l'eau distillée, reinte opalescente, filtrer, prêt à l'emploi. Cette solution n'est valable qu'une demi-journée.

TECHNIQUE

  • graver les lames ou écrire sur la partie réservée à cet effet
  • régler la plaque chauffante sur 3
  • verser sur la lame un peu de solution dollage (éviter les bulles)
  • choisir une bonne coupe, la placer sur la lame (face brillante contre la lame)
  • placer la lame sur la platine
  • égoutter la lame
  • mettre à sécher la lame 1 à 2 heures dans une étuve à 46°
  • NE JAMAIS LAISSER A TEMPERATURE DU LABORATOIRE
  • COLORER IMMEDIATEMENT

DIFFICULTES

  • la paraffine fond rapidement : platine trop chaude
  • les coupes s'étalent partiellement : pas assez de solution de collage

F MONTAGE

  • Nettoyer la lamelle avec un peu de xylène, l'essuyer
  • Mettre à l'aide d'un agitateur un peu de l'Eukitt
  • Sortir la lame du bain de xylène, et SANS l'essuyer déposer la lamelle dessus
  • sans faire de bulle, essuyer le dessous.